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https://repositorio.unipampa.edu.br/jspui/handle/riu/1403| Tipo: | Trabalho de Conclusão de Curso |
| Título : | Desenvolvimento de um protocolo de purificação de DNA Plasmidial pela técnica de Salting-out utilizando Sulfato de Amônio |
| Autor(es): | Pinto, Helber Barboza |
| Primeiro Orientador: | Cañedo, Andrés Delgado |
| Resumo: | O desenvolvimento de protocolos de entrega gênica, como os utilizados para terapia gênica, demanda a obtenção de grandes quantidades de DNA plasmidial (pDNA) com alto grau de pureza. Um dos principais obstáculos da produção de grandes quantidades de pDNA é a própria purificação. Embora existam protocolos de biologia molecular para purificação de pDNA, poucos estão adequados à produção em grande escala e são muito complexos. A técnica de salting-out, onde a precipitação de proteínas e outras biomoléculas é induzida pelo efeito cosmotrópico de alguns sais, pode ser um método simples, rápido e barato de purificação. Com base nesses argumentos, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de purificação de pDNA a partir da técnica de salting-out utilizando sulfato de amônio. A produção dos plasmídeos foi realizada em células de Escherichia coli da linhagem DH5α e extraído pelo método padrão de lise alcalina. Posteriormente, foi testado o método de salting-out com sulfato de amônio nas concentrações de 1, 2 e 3 M. Simultaneamente, diferentes tempos de exposição ao sal foram testados (10, 20 e 30 minutos). Inicialmente, foram realizados testes de precipitação do DNA com álcool isopropílico na quantidade de 0,7 volumes e, também, precipitação com 2 volumes de álcool etílico para observação da eficiência de ambos perante a presença de sal na amostra. Na presença de álcool etílico tivemos precipitação do sal mesmo em baixas concentrações e na presença de álcool isopropílico aconteceu a formação de duas fases sem a precipitação do sal nem do pDNA. Desta forma, foi testado a diluição das soluções com água ultrapura de 1 M até 0,25 M e posterior precipitação em álcool isopropílico, analisando visualmente a formação ou não das duas fases, que não foi visível a partir da concentração de 0,5 M. Portanto, após o tratamento dos lisados com sulfato de amônio as amostras foram diluídas até a concentração salina de 0,5 M e precipitadas com álcool isopropílico, ressuspendidas em água ultrapura e analisadas em gel de agarose, espectrofotometria, HPLC e transferência gênica. Ao mesmo tempo, comparamos o método salting-out com kit de purificação comercial, visualizando a recuperação de pDNA obtido ao fim do processo e a pureza. Os resultados obtidos mostram a eficiência da técnica de salting-out utilizando sulfato de amônio e precipitação em álcool isopropílico. A concentração de sulfato de amônio 2 M apresentou os melhores resultados com remoção de RNA e padrão eletroforético esperado; Este pDNA apresenta relação 260nm/280nm e 260nm/230nm de acordo com o esperado para DNA puro, posteriormente confirmado por HPLC. Ao mesmo tempo, este DNA apresentou-se eficiente para experimentos de transferência gênica gerando dados compatíveis com aqueles obtidos mediante o uso de colunas cromatográficas comerciais para sua purificação. Assim os dados aqui apresentados sugerem que o método é eficiente, possibilitando a obtenção de pDNA com alto grau de pureza e com baixo custo. |
| Resumen : | Development of gene transfer protocols demand high quantities of pure plasmidial DNA (pDNA). One of the purification pitfalls is the complexity of the purification protocols. The salting-out techniques allow to precipitate proteins and another biomolecules through a salt cosmotropic effect. This method can be a simple, fast and low cost system of purification. In this work we aim the establishment of a protocol for pDNA purification through ammonium sulphate treatment. Plasmids were initially produced in Escherichia coli (DH5α strain) and extracted by alkaline lysis. Later, was tested the salting-out method by treating samples with 1, 2 or 3 M ammonium sulphate. At same time, we exposed samples during different times (10, 20 e 30 minutes). Initially, to observe the behavior of the ammonium sulphate solution in the alcohol pDNA precipitation protocol, we tested 0.7 volume of isopropyl alcohol and, also, in 2 volumes of ethyl alcohol. Ethyl alcohol induce the salt precipitation, either in low concentrations. On the other hand, isopropyl alcohol formed a two phase system, without inducing salt precipitation. After, we tested the effect of isopropyl alcohol in ammonium sulphate solution from 0,25 M to 1 M; two phase system was not observed in ammonium sulfate concentrations lower than 0,5 M. Thus, we decides to treat the samples with ammonium sulphate, diluting its concentration to 0,5 M before the precipitation in isopropyl alcohol. pDNA samples were analyzed in agarose gel, spectrophotometrically, by HPLC and in gene transfer protocols. At same time, we compared the salting-out method against a commercial purification kit, analyzing the pDNA yield and purity. The better results were obtained by treating samples with 2 M ammonium sulphate. In this concentration, the product showed low RNA concentration and expected electrophoretic pattern. The obtained pDNA presented 260nm/280nm and 260nm/230nm ratios inside the ranges expected for pure DNA, we thereafter confirmed this purity by HPLC. The pDNA purified were able to transform HEK cell line, showing higher transfection efficiency than that purified by commercial kit. Taken together, our results suggest that our method could be an alternative to produce pure and low cost plasmidial DNA to be used in downstream protocols. |
| Palabras clave : | DNA Purification Salting-out proteins |
| Editorial : | Universidade Federal do Pampa |
| Tipo de acesso: | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil |
| Licença: | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ |
| URI : | http://dspace.unipampa.edu.br/jspui/handle/riu/1403 |
| Fecha de publicación : | 28-nov-2016 |
| Aparece en las colecciones: | Biotecnologia |
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