Desenho e síntese artificial de um vetor para expressão de proteínas heterólogas

Abstract

Até meados de 1970 o DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado e caracterizado. A clonagem veio a permitir um novo olhar para a análise desta biomolécula. A expressão heteróloga de proteínas é extremamente importante para o campo da biotecnologia. O hospedeiro mais comumente utilizado é a bactéria Escherichia coli, por apresentar diversas vantagens como crescimento rápido e eficiente e seu custo ser extremamente barato. Diversos são os vetores utilizados para expressão de proteínas como por exemplo plasmídeos, fagos, cosmídeos e vírus. Os plasmídeos são os vetores mais utilizados para a tecnologia do DNA recombinante pois apresentam um sítio múltiplo de clonagem, além de um marcador de seletividade que é um gene de resistência a antibiótico. Este trabalho teve como objetivo realizar o desenho e construção in silico de um vetor para expressão heteróloga de proteínas que não necessite de subclonagens futuras. Para isto procedeu-se para o desenho racional apresentando algumas regiões de interesse e posteriormente foi sintetizado pela IDT Technologies e apresenta um tamanho de 852 pares de bases. O plasmídeo utilizado foi o pUC19, qual apresenta um tamanho de 2.686 pares de bases. Bactérias E. coli DH5α foram transformadas com pUC19 e posteriormente foi realizado a extração do plasmideo e clivagem com a enzima BamHI. Como passo seguinte foi realizado um PCR livre de enzimas de restrição contendo as amostras do pUC 19 clivadas e a amostra do PCR do constructo realizado anteriormente. Após o PCR de fusão, bactérias E. coli DH5α foram então eletroporadas com o PCR de fusão e realizada a extração. A amostra obtida foi então clivada com a enzima BamHI e aplicada em gel de agarose 1%. Logo após estes procedimentos podemos confirmar a clonagem do constructo, apresentando o tamanho esperado da sua fusão com o plasmídeo, apresentando assim um tamanho final de 3.487 pares de bases. Os resultados deste trabalho possibilitaram o desenvolvimento de um novo sistema para a expressão e purificação de proteínas.

Until the mid-1970s DNA was the most difficult cellular component to be analyzed and characterized. The cloning allowed a new look at the analysis of this biomolecule. The heterologous expression of proteins is extremely important for the field of biotechnology. The most commonly used host is the bacterium Escherichia coli, because it has several advantages such as rapid and efficient growth and its cost is extremely cheap. A number of vectors are used for expression of proteins such as plasmids, phages, cosmids, and viruses. Plasmids are the most commonly used vectors for recombinant DNA technology because it has a multiple cloning site as well as a selectivity marker which is an antibiotic resistance gene. The objective of this work was to design and construct a vector in house for heterologous expression of related proteins that does not require future subcloning. For this we proceeded to the rational design presenting some regions of interest and it was later synthesized by IDT Technologies and has a size of 852 base pairs. The plasmid used was pUC19 of which it had a size of 2668 base pairs. E. coli DH5α bacteria were transformed with pUC19 and subsequently the plasmid extraction and cleavage with the BamHI enzyme was performed. As a next step a free restriction enzyme PCR was performed containing the cleaved pUC 19 samples and the PCR sample from the above construct. After fusion PCR, E. coli DH5α bacteria were then electroporated with the fusion PCR and extraction was performed. The obtained sample was then cleaved with the BamHI enzyme and applied on 1% agarose gel. Soon after these procedures we can confirm the cloning of the construct, showing the expected size of its fusion with the plasmid thus presenting a final size of 3.487 base pairs. The results of this work enabled the development of a new system for the expression and purification of proteins.