Obtenção e conservação da enzima β-galatcosidase a partir de células permeabilizadas de Kluyveromyces marxianus CCT 7082

Abstract

As enzimas são biocatalisadores de grande interesse industrial, pois apresentam vantagens frente aos catalisadores químicos e representam alternativa sustentável aos processos industriais. A β-galactosidase é uma importante enzima, possuindo inúmeras aplicações na indústria de alimentos, dentre as quais, destacam-se a hidrólise da lactose e a síntese de galacto-oligossacarídeos. A levedura Kluyveromyces marxianus é importante fonte de β-galactosidase, a qual quando produzida por este micro-organismo é intracelular. A permeabilização celular é uma técnica alternativa que visa o acesso aos compostos intracelulares sem que seja preciso submeter a célula a drásticos tratamentos. Solventes orgânicos e detergentes são reportados na literatura para permeabilização de células microbianas com bons resultados. Após a obtenção da enzima é necessário o emprego de técnicas para a conservação, que colaborem para a manutenção da atividade enzimática durante o período de armazenamento. Este trabalho teve como objetivo empregar solventes orgânicos e detergentes em diferentes concentrações para a permeabilização de células da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082, bem como avaliar o emprego de ultra-congelamento (-86°C) e liofilização como formas de conservação da enzima β-galactosidase nas células permeabilizadas. Os agentes permeabilizantes testados foram: álcool metílico, acetona, isopropanol, etanol, acetato de etila, hexano, Tween 20 e Triton X-100. As concentrações testadas variaram de 20 a 50% (p/v) e 100% para os solventes e de 0,5 a 1,5% (p/v) para os detergentes. Os agentes permeabilizantes foram preparados em tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0. Os solventes apresentaram melhores resultados de permeabilização que os detergentes testados. O álcool metílico 35% (p/v) foi escolhido como o melhor agente permeabilizante e as células permeabilizadas com esse agente foram submetidas a dois tratamentos de conservação (ultra-congelamento a -86°C e liofilização). Realizou-se o acompanhamento da atividade da enzima antes e após 24 horas dos tratamentos de conservação e a cada 5 dias, durante o período total de 30 dias. A liofilização resultou em perda de mais de 50% da atividade da enzima em 20 dias. Já, o ultra-congelamento proporcionou maior permeabilização das células após 24 horas do tratamento e manutenção da atividade enzimática superior ao valor inicial ao longo de 25 dias. Nas células mantidas congeladas a -86°C em 30 dias notou-se redução de 13,42% da atividade inicial da enzima. Nesse sentido, a permeabilização das células da levedura Kluyveromyces marxianus para obtenção de β-galactosidase foi eficaz. No entanto, maiores estudos a respeito dos métodos de conservação da enzima em células permeabilizadas, são necessários de forma a viabilizar o seu uso industrialmente.

Enzymes are biocatalysts of great industrial interest, since they have advantages over chemical catalysts and represent sustainable alternative to industrial processes. The β galactosidase is an important enzyme having numerous applications in the food industry, among which stands out the hydrolysis of lactose and the synthesis of galactooligosaccharides. The Kluyveromyces marxianus yeast is an important source of β-galactosidase, which when produced by this microorganism is intracellular. Cell permeabilization is an alternative technique which seeks access to intracellular compounds without having to undergo drastic treatments cell. Organic solvents and detergents are reported in the literature for permeabilization of microbial cells with good results. After obtaining the enzyme is necessary to use techniques for conservation, to cooperate for the maintenance of enzyme activity during the storage period. This study aimed to employ organic solvents and detergents in different concentrations to the yeast cell permeabilization Kluyveromyces marxianus CCT 7082, and to evaluate the use of ultra-freezing (-86 ° C) and lyophilization as forms of conservation of enzyme β- galactosidase activity in permeabilized cells. Permeabilizants agents tested were: methyl alcohol, acetone, isopropanol, ethanol, ethyl acetate, hexane, Tween 20 and Triton X100. The concentrations tested ranged from 20 to 50% (w / v) and 100% for the solvent and from 0.5 to 1.5% (w / v) to detergents. The permeabilizants agents were prepared in 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.0. The solvents outperformed permeabilization that the tested detergents. Methyl alcohol 35% (w / v) was chosen as the best permeabilizer and the cells permeabilized with this agent were subjected to two treatments preservation (freezing to ultra -86 ° C and lyophilization). We carried out the monitoring of enzyme activity before and after 24 hours of preservation treatments and every 5 days during the whole period of 30 days. Lyophilization resulted in a loss of more than 50% of the enzyme activity at 20 days. Since the ultra-freezing afforded increased permeabilization of the cells after 24 hours of treatment and the maintenance of enzyme activity higher than the initial value over 25 days. In the cells kept frozen at 86 ° C was noted within 30 days a reduction of 13.42% of the initial enzyme activity. Accordingly, the permeabilization of yeast Kluyveromyces marxianus cells to obtain β-galactosidase was effective. However, further studies on the enzyme conservation methods in permeabilized cells, are needed in order to enable its use industrially.